一、實驗方法原理
本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
 
這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。

二、實驗材料
1.樣本：血清 血漿 體液
2.試劑、試劑盒：碳酸鹽包被緩沖液 抗體球蛋白 吐溫 檸檬酸 硫酸
3.耗材：酶標(biāo)比色計 96孔板 移液槍 離心管 離心管盒

三、實驗步驟
1.包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至適濃度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時，貯存冰箱。
 
2.洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
3.每凹孔加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標(biāo)本，37℃作用1～2小時。
 
4.洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
5.加入0.2 ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液，37℃作用1～2小時或由預(yù)試實驗確定作用時間。
 
6.洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。
 
7.加入0.2ml底物溶液于每個凹孔(OPD或OT)，室溫作用30分鐘（另作一空白對照，0.4 ml底物加0.1 ml終止劑）。
 
8.加終止劑：每凹孔加2M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 ml。
 
9.觀察記錄結(jié)果：目測或用酶標(biāo)比色計測定（OPD用492nm）OD值。

四、注意事項
1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。

2.包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。

3.對某些抗原必須進(jìn)行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動物的臟器等，它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。

4.用適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì)，而且可以克服前帶現(xiàn)象?？赏ㄟ^棋盤滴定法進(jìn)行測定，但用單項滴定法更為簡便，其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌，再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應(yīng)后分別測定OD值，選擇OD值≥1.0的那個抗原稀釋度為適包被濃度。一般總是要選擇那個OD值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。