牛磺膽酸鈉酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。

1  使用目的： 本試劑盒用于飼料、魚、蝦和肉類組織（如雞、牛肉和豬肉），血清和尿樣中牛磺膽酸

鈉殘留的定量檢測。

2  實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用競爭 ELISA 方法，在微孔板包被有牛磺膽酸鈉偶聯(lián)抗原，加入牛磺膽酸 鈉標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離牛磺膽酸鈉與微孔條上預(yù)包被的牛磺膽酸鈉偶聯(lián)抗原互相競爭抗牛磺 膽酸鈉抗體酶標(biāo)記物，用 TMB 底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在

450nm 波長下進(jìn)行檢測，吸光值與樣品中牛磺膽酸鈉含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中 牛磺膽酸鈉的含量。

3  試劑盒組成

3.1  預(yù)包被的牛磺膽酸鈉偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1 塊（12 孔×8 條）。

3.2 牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品：6 瓶（1ml/瓶），含量分別是： 0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb。

3.3 抗牛磺膽酸鈉抗體酶結(jié)合物：1 瓶（6ml）。

3.4 顯色液 A：1 瓶（6ml）。

3.5 顯色液 B：1 瓶（6ml）。

3.6 終止液：1 瓶（6ml），2M 硫酸。

3.7 樣本稀釋液：1 瓶（10×,  6ml），用于樣品稀釋用。

3.8 濃縮洗滌液：1 瓶（20×，20ml），用于洗板。

3.9 說明書一份。

4  需要而未提供的材料

4.1  設(shè)備

4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀。

4.1.2粉碎機(jī)。

4.1.3量筒。

4.1.4振蕩器。

4.1.5漏斗。

4.1.6Whatman 或相當(dāng)?shù)臑V紙。

4.1.7微量移液器。

4.2  試劑

4.2.1去離子水或蒸餾水。

4.2.2 甲醇。

5  貯存

5.1  試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍

5.2  未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存

6  注意事項(xiàng)

6.1  使用試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書。

6.2  不要使用過期試劑盒。

6.3  試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時(shí)。

6.4  標(biāo)準(zhǔn)品中含有牛磺膽酸鈉，使用時(shí)應(yīng)特別注意，操作時(shí)應(yīng)帶手套。

6.5  終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。

6.6  不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。

6.7  不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會(huì)影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

6.8  稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6.9  混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡。

7  工作液準(zhǔn)備

7.1  牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb

7.2  濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用

7.3  樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用

7.3  顯色劑：已備用，避免光線直照

7.4  反應(yīng)終止液：已備用

8  樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則 會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

8.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液

8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘

8.3用Whatman 濾紙過濾

8.4取25μl處理后的樣品，加入25μl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）

9  酶免分析步驟

9.1  實(shí)驗(yàn)須知

9.1.1 實(shí)驗(yàn)開始前請(qǐng)將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)。回溫至室 溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存 注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的度和準(zhǔn)確度。

9.1.2 使用后請(qǐng)立即將試劑放回2~8℃保存

9.1.3 請(qǐng)不要改變分析程序

9.1.4 請(qǐng)使用的微量移液器

9.1.5 操作一旦開始，請(qǐng)不要中斷任何程序

9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請(qǐng)嚴(yán)格按照要求操作

9.1.7 為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣

9.1.8 加樣時(shí)請(qǐng)勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面

9.2  分析步驟

9.2.1 預(yù)先進(jìn)行編號(hào)，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測

9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存

9.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)

9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液

9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液

9.2.6 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液

9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗牛磺膽酸鈉抗體酶結(jié)合物

9.2.8 輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘。

9.3 37℃溫浴30min  （溫浴過程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）

9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液

體。

9.4  反應(yīng)

9.4.1  洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50μl顯色液A，再加  50μl顯 色液B；輕微晃動(dòng)反應(yīng)板使之*混勻

9.4.2 37℃溫浴10min

9.4.3 每孔中加入50μl終止液，混勻

9.4.4 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。

10 結(jié)果計(jì)算

10.1定量分析

10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)） 的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。 B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

10.1.2以牛磺膽酸鈉濃度的對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品 百分吸光度值，可從曲線上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為牛磺膽酸鈉濃度的對(duì)數(shù)值，求得反對(duì) 數(shù)即為測定液中牛磺膽酸鈉濃度C（ppb）

10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋 倍數(shù)。

10.2 半定量測定

10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光 度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色 深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

11 特異性

物質(zhì) 交叉反應(yīng) 牛磺膽酸鈉 100%

12 試劑盒參數(shù) 本試劑盒檢測下限為0.05ppb B0吸光度*值應(yīng)大于1.0

試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。 用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。

13

試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb。

14 分析限制 本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。